淀粉样变性是一种以错误折叠的蛋白质在细胞外积聚为不溶性原纤维为特征的疾病，可导致组织损伤和器官功能障碍。淀粉样变性可根据组织中积累的蛋白质类型进行分类，目前已识别出36种淀粉样变性。转甲状腺素蛋白淀粉样变(transthyretin amyloidosis，ATTR)是最常见的淀粉样变性之一，由全长和片段化的转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)单体形成的淀粉样物质沉积所致引起^[1]。TTR是一种四聚体蛋白，主要由肝脏合成并分泌到血浆中。当TTR错误折叠为淀粉样物质后并沉积于心肌间质，可导致心肌病变，最终进展为限制型心肌病和进行性心力衰竭，即转甲状腺素蛋白心脏淀粉样变(transthyretin cardiac amyloidosis，ATTR-CA)。TTR解离物质沉积在神经系统可造成神经病变，发展为转甲状腺素蛋白淀粉样变性多发性神经病(transthyretin amyloid polyneuropathy，ATTR-PN)。根据病因不同，ATTR主要分为遗传型ATTR(hereditary ATTR，hATTR)，也称为突变型ATTR(mutant ATTR，ATTRm)和野生型ATTR(wild-type ATTR，ATTRwt)。ATTRm为常染色体显性遗传，由TTR基因突变引起^[2]。

1.   转甲状腺素蛋白淀粉样变心肌病发病机制

TTR的异常解聚是该病发生的核心机制。TTR主要由肝脏产生，当TTR基因单个核苷酸发生突变时，TTR四聚体就容易解离为单体, 并错误折叠产生不可溶性淀粉样物质沉积于器官或组织的细胞外区^[3]。多数研究认为淀粉样沉积物的物理破坏性是导致器官功能障碍的主要原因，也有证据表明具有毒性的前纤维状淀粉样蛋白才是破坏心脏功能的主要因素。ATTRm可以表现为神经病变、心肌病变或者二者混合^[4]。ATTRwt的发病机制目前尚未阐明，可能与氧化应激和退行性变有关，也会导致TTR蛋白沉积，主要表现为心肌病变。基于ATTR的病理生理机制，治疗方案包括抑制肝脏TTR合成、稳定TTR四聚体或靶向基因沉默。

2.   转甲状腺素蛋白淀粉样变心肌病治疗策略

转甲状腺素蛋白淀粉样变心肌病(transthyretin amyloidosis cardiomyopathy, ATTR-CM)的治疗方法包括器官移植与药物治疗^[5]。原位肝移植(orthotopic liver transplantation，OLT)是治疗ATTR最早且有效的方法^[6]，通过移植正常肝脏组织可以终止突变型TTR的生成。1990年有学者首次提出OLT可作为ATTR的潜在治愈方法。2011年OLT和肝心联合移植是唯一可用来改善ATTR的疗法^[7-8]。但肝移植后组织TTR沉积仍可能继续^[10]，供体稀缺及长期排异治疗等也是肝移植的局限。目前药物治疗主要是两种，一种是TTR四聚体稳定剂，减少TTR四聚体的解离，从而减少淀粉样变的产生^[11]，包括通过结合TTR上的T4结合位点起到稳定TTR四聚体作用的小分子药物[氯苯唑酸(tafamidis)、二氟尼柳(diflunisal)等] 和通过模仿超稳定TTR变体T119M的结构影响来防止单体错误折叠和沉积(acoramidis)。氯苯唑酸是唯一获批的治疗ATTR-CM的药物。2020年2月5日，中国国家药品监督管理局(National Medical Products Administration，NMPA)批准氯苯唑酸葡胺软胶囊(20 mg/粒)上市用于治疗ATTR-PN。2020年10月批准氯苯唑酸游离酸胶囊(61 mg/粒)上市用于治疗ATTR-CA^[12]。有研究发现^[13]，氯苯唑酸可分别使ATTRm-CA和ATTRwt-CA患者的全因死亡率分别降低31.0%和29.4%，基于该ATTR-ACT研究结果，氯苯唑酸纳入《2019欧洲心脏病学会心衰协会专家共识》，确诊为ATTR所致的心力衰竭患者，应考虑使用氯苯唑酸进行治疗^[14]。另一种是与编码TTR蛋白的mRNA相结合，从基因水平降低肝内TTR合成的药物，例如，小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA) (patisiran、revusiran和vutrisiran)、反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASO)(inotersen和eplontersen), 以及基因编辑策略(CRISPR-Cas9)技术。

3.   转甲状腺素蛋白淀粉样变心肌病的治疗药物

3.1   小干扰RNA药物

siRNA是20~25个核苷酸长的双链RNA分子，可与互补的信使RNA(messerger RNA, mRNA)分子结合并使其降解，从而调节基因表达。siRNA在体内需避免被吞噬细胞摄取及被核酸酶降解。为实现以上目标，目前已研究出核苷酸的化学修饰或脂质递送系统传递siRNA^[16-17]。目前siRNA已在血液病、肿瘤疾病、心血管疾病等领域中进行多项临床研究^[18-20]，patisiran治疗ATTR-CM已经进入临床测试阶段^[21]，其他siRNA药物治疗ATTR-CM正在Ⅱ期和Ⅲ期试验中。

3.1.1   Patisiran

Patisiran是一种封装在脂质纳米颗粒(直径60~100 nm)中的siRNA药物，可保护RNA分子免受内切核酸酶和外切核酸酶降解，递送至肝脏。脂质纳米颗粒被载脂蛋白E包裹，与肝细胞膜上的LDL受体结合。RNA双链体在细胞质中特异性结合TTR mRNA(野生型或变体)3′非翻译区(UTR)中的序列，阻断TTR蛋白合成。Patisiran按照每3周0.3 mg/kg的给药方案，在24周时达到稳态血药浓度。Patisiran被代谢成各种长度的核苷酸，＜1%以原形从尿液中排出。消除半衰期为(3±2)d。慢性肾功能不全和轻度肝功能损害对药代动力学无实质性影响。Patisiran不经过细胞色素P450酶或转运蛋白代谢，药代动力学不受细胞色素P450诱导剂或抑制剂的影响^[22]。

一项Ⅱ期临床试验研究显示^[23-24]，29例变异ATTR(varient ATTR, ATTRv)患者接受每3周两次0.3 mg/kg的剂量后，血清TTR水平相对于基线的平均降低超过85%，最大值为96%。APOLLO Ⅲ期临床试验评估patisiran治疗ATTRm多发性神经病变患者的有效性和安全性^[25], 该研究纳入了全球19个国家225例ATTRm多发性神经病变患者，APOLLO的心脏亚组分析评估了126例(56%)患者使用patisiran的效果，在治疗18个月后，与安慰剂组相比，patisiran组的左心室整体纵向应变有所降低[(-1.4±0.6)%，P=0.015]，心排血量增加[(0.38±0.19)L/min，P=0.044]。与安慰剂组相比，patisiran组患者左心室壁厚度降低[(-0.9±0.4)mm；P=0.017]，与心脏相关的住院率和全因死亡率降低46%。2021年发表的一项研究^[26]比较16例接受patisiran治疗12个月的ATTRv患者和16例未经治疗的ATTRv淀粉样变性患者，与安慰剂组相比，接受patisiran治疗的患者心脏磁共振(cardiac magnetic resonance，CMR)显影剂钆在瘢痕组织或淀粉样物质沉积区(间质扩张区)积聚减少(平均差-6.2%；P=0.001)，6分钟步行距离(six minutes walk distance，6MWD)增加，N端脑钠肽前体(N-terminal pro-B type natriuretic peptide，NT-proBNP)水平降低，未观察到左心室结构或功能的变化，说明淀粉样变性心肌病的改善可能需要进一步的影像学研究来证明。APOLLO-B(NCT03997383)旨在研究patisiran作为ATTR-CM的有效性和安全性，该试验招募具有心力衰竭病史的ATTRv-CM或ATTRwt-CM患者，目前尚未公布结果^[27]。

在一项Ⅱ期研究中^[24]，接受patisiran治疗的患者中有10%发生轻度至中度输液相关反应，未观察到肝肾功能或血液学显著变化，无导致治疗中断的药物相关不良事件。APOLLO试验中的大多数不良事件为轻度或中度。最常见的不良事件是腹泻、外周水肿、跌倒、恶心、输液相关反应、便秘和尿路感染等。心脏不良事件发生率两组无显著性差异。在一项为期12个月的全球OLE研究中^[28], 1%的患者发生了与治疗相关的严重不良事件：1例患者腹部不适，1例患者发生两次与药物外渗相关的不良事件。

Patisiran于2018年获得美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)和欧洲药品管理局(European Medicines Agency，EMA)的批准^{[22, 29]}，用于治疗患有Ⅰ期或Ⅱ期ATTRv-PN的成年患者。对于体重＜100 kg的患者，推荐剂量为0.3 mg/kg，每3周一次。对于体重≥100 kg的患者，推荐剂量为30 mg，每3周一次。由于patisiran可以降低维生素A水平，建议每天补充约2500 IU维生素A。

3.1.2   Vutrisiran

Vutrisiran(也称为ALN-TTRsc02)是另一种靶向TTR mRNA的siRNA。Vutrisiran是一种GalNAc缀合物，与patisiran相比，其给药间隔更久。在Ⅰ期研究中，vutrisiran在皮下给药后迅速吸收，给药后3~5 h之间达到血药浓度峰值(C_max)，平均半衰期为4.2~7.5 h，肾脏清除率占15.5%~27.5%^[30]。

在一项Ⅰ期临床研究中^[30]，80名健康人群接受单剂量(5~300 mg)vutrisiran(n=60)或安慰剂(n=20)，结果表明，vutrisiran治疗安全且耐受性良好，血浆中TTR水平降低57%~97%，最低TTR水平在50~90 d达到。90 d后所有剂量组的血浆TTR水平开始恢复。HELIOS-A试验是一项正在进行的Ⅲ期研究，评估vutrisiran在164例ATTRv-PN患者中的疗效和安全性^[31]，HELIOS-B试验^[32]探究vutrisiran在ATTRv-CM或ATTRwt-CM患者中的疗效和安全性，预计在2024年初公布结果。在Ⅰ期研究中，vutrisira最常见的不良事件是鼻咽炎、头痛、腹泻和恶心, 以及注射部位疼痛。在一些接受治疗的患者中观察到谷丙转氨酶水平短暂升高，主要发生在vutrisiran剂量≥100 mg时。在HELIOS-A研究中，vutrisiran在给药9个月时未发生与药物相关的停药或死亡。

Vutrisiran于2022年6月在美国获批用于治疗成人hATTR淀粉样变性多发性神经病，2022年7月在欧洲获批用于治疗成人1期或2期多发性神经病变患者的hATTR淀粉样变性。

3.1.3   Revusiran

Revusiran也是一种针对TTR mRNA的siRNA药物。Revusiran在Ⅱ期ENDEAVOR试验中评估200例ATTRv-CM患者的6MWD和血清TTR，13%接受revusiran的患者和3%接受安慰剂的患者在中位7个月内死亡，较高比例患者死于心力衰竭，该研究随后终止，死亡患者的年龄通常≥75岁，基线时的心力衰竭进展严重^[33]。

3.2   ASO药物

ASO是由16~20个碱基对的单链合成寡核苷酸，可以通过多种机制沉默靶mRNA序列，主要涉及内源性核糖核酸酶RNaseH1介导的降解。基于ASO的药物已被美国FDA批准作为多种疾病的疾病缓解疗法，包括巨细胞病毒性视网膜炎、杜氏肌营养不良症、家族性淀粉样多发性神经病、纯合子家族性高胆固醇血症、新生血管性年龄相关性黄斑变性、窦性阻塞综合征和脊髓性肌萎缩症萎缩等^[34]。

3.2.1   Inotersen

Inotersen是一种2′-O-甲氧基乙基修饰的ASO TTR表达抑制剂，通过结合野生型和变体TTR(TTR mRNA)的3′非翻译区起作用。Inotersen皮下注射后，迅速吸收到体循环中，大部分(＞94%)可与血浆蛋白结合。注射后1.5~4 h内达到C_max。注射后24 h药物迅速分布到组织，C_max降低＞90%；之后缓慢消除，终末半衰期约为1个月。Inotersen不经过细胞色素P450代谢，可被内切核酸酶降解为更短的无活性寡核苷酸。Inotersen及其代谢物均通过尿液排泄^[35]。

Inotersen的一项Ⅰ期研究^[36]显示血液中TTR水平呈剂量依赖性降低，在50、100、200、300和400 mg剂量方案中，从基线到第4周血清TTR水平的平均百分比变化分别为-8%、-22%、-53%、-75%和-76%。TTR抑制随时间延长而延长，在最后一次inotersen给药10周后，300 mg和400 mg组的平均血清TTR水平比基线下降了30%。Inotersen治疗后维生素A水平也随时间下降，未观察到与维生素A缺乏相关的不良事件。在任何治疗方案亚组中均未报告严重不良事件。一项Ⅱ期研究^[37]对50例ATTR-CM(变异型或野生型)患者进行为期24个月的疗效和安全性评估，患者在基线和12、18和24个月时接受超声心动图评估和CMR。主要终点是左心室纵向应变较基线的变化。目前结果仍未公布。NEURO-TTR临床研究^[38]显示，在ATTRm合并周围神经病变患者中inotersen均可使TTR蛋白水平显着降低，同时改善ATTRm患者的神经系统评分和生活质量。心脏病亚组在15个月的随访中，inotersen组和安慰剂组在整体纵向应变或其他超声心动图变量(壁厚、左室质量、左室射血分数和侧位E/E′)上均未观察到显著性差异。

在NEURO-TTR试验^[38]中，不良事件(14%)是inotersen组停药的主要原因。20%接受inotersen治疗的患者中发生注射部位疼痛、恶心、头痛、疲劳、发热和血小板减少症等不良反应。其中5例死亡，均发生在inotersen组，1例严重血小板减少患者死于颅内出血。在inotersen组中，54%的患者发生血小板计数降至140 000/mm³以下, 3%的患者血小板计数降至25 000/mm³以下。血小板减少最可能的机制是由免疫介导的血小板减少，部分患者在糖皮质激素治疗后恢复，并检测到抗血小板抗体。建议在开始inotersen治疗前和治疗中密切监测血小板数量。3%接受inotersen的患者发生肾小球肾炎，治疗开始前和治疗中应同时密切监测肾功能。在NEURO-TTR试验中，患者均补充了维生素A，故未报告维生素A缺乏的临床表现。意大利一项真实世界研究共纳入23例患者，无患者因血小板减少而永久停止治疗，也未观察到严重血小板减少的病例^[39]。

Inotersen于2018年获得FDA和EMA批准上市^{[35, 40]}，用于治疗1期或2期ATTRv-PN成人患者，剂量为284 mg/周。Inotersen禁用于血小板计数＜100 000/mm³、肾小球滤过率＜45 mL/(min·1.73 m²) 的患者。建议所有接受治疗的患者每日口服补充约3000 IU的维生素A。

3.2.2   Eplontersen

Eplontersen是一种与inotersen具有相同的序列的ASO，可与GalNAc偶联，GalNAc3部分通过内吞途径被切割。在体外人类肝细胞中，eplontersen在降低TTR表达方面的效力是inotersen的50倍, 在表达人Ile84SerTTR变体的转基因小鼠中，eplontersen诱导的TTR表达下降是inotersen的28倍，血浆TTR水平降低15倍。Eplontersen在皮下给药后迅速分布到体循环中，达到C_max的中位时间为1~6 h。终末半衰期为2~4周^[41]。

一项评估eplontersen在健康志愿者中的随机、安慰剂对照、Ⅰ期研究中^[41]，单剂量120 mg eplontersen给药后第29天，血清TTR水平从基线最大降低86%。多剂量研究中，45、60和90 mg剂量组的第4次给药后2周，血清TTR水平分别降低了86%、91%和94%。Eplontersen的Ⅱ期、单中心、开放标签研究^[42]招募ATTR-CM患者，评估超声心动图、实验室评估、6MWD测试、心肺运动测试及可行的CMR，预计研究将于2025年完成。Eplontersen一项正在进行的Ⅲ期多中心、双盲、随机对照研究^[43]在750例ATTR-CM患者中进行，主要终点将是第120周时心血管死亡率和复发性心血管临床事件发生率。Ⅰ期临床试验中接受eplontersen治疗的患者未报告严重的不良事件，最常见的不良事件包括头痛、丙氨酸氨基转移酶及肌酸磷酸激酶水平的短暂升高^[41]。

3.3   CRISPR-Cas9基因编辑药物

CRISPR-Cas9可实现靶向体内基因组编辑。核酸酶(Cas9)与单向导RNA复合，可以通过载体将其输送到特定细胞中。在细胞内部，CRISPR-Cas9在特定的遗传位置诱导双链断裂，使目标蛋白生成减少^[44]。ATTR淀粉样变性是CRISPR-Cas9介导的基因编辑的理想目标，因为基于siRNA和ASO药物治疗证明TTR敲除对ATTR淀粉样变性患者有效^[45]。此外，通过基因沉默抑制TTR不会影响甲状腺功能，仅需补充维生素A即可预防与TTR缺乏相关的临床后遗症。体内TTR几乎完全由肝细胞产生，目标组织可被输送系统准确定位^[46]。

2018年，Finn等^[47]设计了一种基于生物可降解脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles，LNP)的递送系统，通过CRISPR-Cas9进行体内编辑。LNP被载脂蛋白E覆盖，载脂蛋白E与肝细胞膜上的LDL受体结合，使整个递送系统发生主动内吞。单次给药后小鼠血清TTR水平降低高达97%，且持续12个月，在携带人类Val30MetTTR变体的大鼠、食蟹猴和转基因小鼠中均得到类似的结果，且无明显的不良事件。

基于这一证据，Gillmore等^[45]进行了Ⅰ期研究，3例ATTRv-PN患者接受静脉注射单剂量方案(0.1或0.3 mg/kg)的NTLA-2001(基于CRISPR-Cas9系统的TTR体内编辑基因)。患者预先接受糖皮质激素和抗组胺药治疗以预防过敏反应。在注射后28 d，NTLA-2001低剂量和高剂量方案中TTR从基线水平分别降低52%和87%，且无任何严重的不良事件。CRISPR-Cas9介导的基因编辑导致TTR几乎完全敲低表达。这种敲低在单次注射后是持续性的，与目前需要连续输注的siRNA和ASO疗法相比，具有明显优势。后续将扩大研究队列，Ⅱ和Ⅲ期试验于2022年进行，目前暂无研究结果发表成文。

4.   结语

TTR基因沉默所致维生素A缺乏容易被纠正，未来的研究应确定是否具有除维生素A缺乏外的其他不良反应。实验和临床研究均表明TTR具有重要的神经保护活性，长期治疗降低TTR在肝脏中的特异性表达是否会导致该神经保护功能的丧失需要进一步研究。对ATTR-CM治疗效果可能需要更细化的心脏评估。当治疗变化较小时，左室射血分数变化不能完全反应出心脏功能对治疗的敏感性，全局纵向应变可对ATTR-CM患者进行纵向评估的工具^[48]。

siRNA疗法可显著降低循环中TTR水平，并改变调节TTR淀粉样纤维形成。有关氯苯唑酸和patisiran的初步数据显示，接受氯苯唑酸的ATTR-CM患者病情得到控制，接受patisiran的ATTRv淀粉样变性伴心脏受累患者的心脏结构和功能得到改善。正在进行的APOLLO-B27和HELIOS-B67试验将进一步阐明siRNA疗法对心脏受累的影响。与氯苯唑酸疗法的每日一次方案和acoramidis疗法的每日两次方案相比，patisiran每3周给药一次和vutrisiran每3个月给药一次均成为其优势。基于作用机制的不同，TTR靶向siRNA疗法和TTR四聚体稳定剂可以联合治疗, 成本效益较高^[49]。因此，siRNA可作为替代选择，可根据已完成和正在进行的临床试验的结果选择最佳治疗方案。ASO与使用siRNA patisiran治疗相比，inotersen疗法不会导致循环TTR水平的更大降低，但与血小板减少症和肾小球肾炎的风险增加有关，并且必须每周给药。CRISPR-Cas9治疗ATTRv淀粉样变性患者单次给药能够延缓疾病的发展。氯苯唑酸是目前唯一获批用于ATTR-CM和ATTRv-PN的治疗药物，siRNA药物patisiran和ASO inotersen已获批用于治疗ATTRv-PN患者。基因编辑技术处于开发的早期阶段^[50]。未来更多治疗ATTR-CM的新型药物上市，可为ATTR-CM患者带来曙光。